1 主题内容与适用范围
本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。
本标准适用于食品中大肠菌群的测定。
2 术语
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽
胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质
量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
3 引用标准
GB 478.28 食品卫生微生物学检验 染色法 培养基和试剂
4 设备和材料
4.1 温箱：36±1℃。
4.2 冰箱:0～4℃。
4.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。
4.4 天平。
4.5 显微镜。
4.6 均质器或乳钵。
4.7 平皿:直径为90mm。
4.8 试管。
4.9 吸管。
4.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
4.11 玻璃珠:直径约5mm。
4.12 载玻片。
4.13 酒精灯。
4.14 试管架。
5 培养基和试剂
5.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
5.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
5.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
5.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
5.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
5.6 生理盐水。
5.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
6 检验程序
大肠菌群检验程序如下:
┌─────┐
│ 检样 │
└──┬──┘
┌──┴──┐
│ 稀释 │
└──┬──┘
┌─────┴─────┐
│ 乳糖胆盐发酵管 │
│ 36 ±1℃ ,24±2h │
└─┬───────┬─┘
┌───┴─┐ ┌─┴───┐
│ 不产气 │ │ 产气 │
└──┬──┘ └─┬───┘
┌──┴───┐┌───┴───────┐
│大肠菌群阴性││ 伊红美蓝琼脂平板 │
└──┬───┘│ 36 ±1℃ ,18±24 │
┌──┴──┐ └──┬─────┬──┘
│ 报告 │┌───┴─┐ ┌─┴───────┐
└─┬───┘│革兰氏染色│ │ 乳糖发酵管 │
│ └──┬──┘ │36 ±1℃ ,24±2h │
│ │ └─┬──────┬┘
┌─┴───┐┌──┴───┐┌─┴───┐┌─┴───┐
│革兰氏阳性││革兰氏阴性 ││ 产气 ││ 不产气 │
└─┬───┘│无芽胞杆菌 │└┬────┘└─┬───┘
│ └────┬─┘ │ │
┌─┴────┐ ┌┴───┴─┐┌────┴─┐
│大肠菌群阴性│ │大肠菌群阳性││大肠菌群阴性│
└─┬────┘ └───┬──┘└────┬─┘
┌─┴───┐ ┌──┴──┐ ┌───┴─┐
│ 报 告 │ │ 报 告 │ │ 报 告 │
└─────┘ └─────┘ └─────┘
7 操作步骤
7.1 检样稀释
7.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌
玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的
均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10
的均匀稀释液。
7.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液
的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
7.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1
支1mL灭菌吸管。
7.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释
度,接种3管。
7.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发
酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃
温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如
有产气者,则按下列程序进行。
7.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃ 温箱内,培养18-24h,
然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
7.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵
管,置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为
阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
7.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
8 粪大肠菌群(faecal coliform)
8.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见7.2条)转 种于EC肉汤管内,
置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养
后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉
汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证
实为粪大肠菌群阳性。
8.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群
的MPN值。
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
┌──────────────────┬─────┬─────┐
│ 阴性管数 │ MpN │95％可信限│
├─────┬─────┬──────┤100 mL(g) ├──┬──┤
│1mL(g)，*3│0.1mL(g)*3│0.0lmL(g)*3 │ │下限│上限│
├─────┼─────┼──────┼─────┼──┼──┤
│ 0 │ 0 │ 0 │ ＜30 │＜5│ │
│ 0 │ 0 │ 1 │ 30 │ │ │
│ 0 │ 0 │ 2 │ 30 │ │90 │
│ 0 │ 0 │ 3 │ 30 │ │ │
├─────┼─────┼──────┼─────┼──┼──┤
│ 0 │ 1 │ 0 │ 30 │＜5│ │
│ 0 │ 1 │ 1 │ 60 │ │130 │
│ 0 │ 1 │ 2 │ 90 │ │ │
│ 0 │ 1 │ 3 │ 120 │ │ │
└─────┴─────┴──────┴─────┴──┴──┘
续表
┌───────────────────┬────┬─────┐
│ 阳性管数 │ MPN │95％可信限│
├─────┬──────┬──────┤100mL(g)├──┬──┤
│1mL(g)×3 │0.l mL(g)x3 │0.0lmL(g)X3 │ │下限│上限│
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 0 │ 2 │ 0 │ 60 │ │ │
│ 0 │ 2 │ 1 │ 90 │ │ │
│ 0 │ 2 │ 2 │ 120 │ │ │
│ 0 │ 2 │ 3 │ 160 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 0 │ 3 │ 0 │ 90 │ │ │
│ 0 │ 3 │ 1 │ 130 │ │ │
│ 0 │ 3 │ 2 │ 160 │ │ │
│ 0 │ 3 │ 3 │ 190 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 1 │ 0 │ 0 │ 40 │＜5 │200 │
│ 1 │ 0 │ 1 │ 70 │ 10 │210 │
│ 1 │ 0 │ 2 │ 110 │ │ │
│ 1 │ 0 │ 3 │ 150 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 1 │ 1 │ 0 │ 70 │10 │230 │
│ 1 │ 1 │ 1 │ 110 │ 30 │360 │
│ 1 │ 1 │ 2 │ 150 │ │ │
│ 1 │ 1 │ 3 │ 190 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 1 │ 2 │ 0 │ 110 │ 30 │360 │
│ 1 │ 2 │ 1 │ 150 │ │ │
│ 1 │ 2 │ 2 │ 200 │ │ │
│ 1 │ 2 │ 3 │ 240 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 1 │ 3 │ 0 │ 160 │ │ │
│ 1 │ 3 │ 1 │ 200 │ │ │
│ 1 │ 3 │ 2 │ 240 │ │ │
│ 1 │ 3 │ 3 │ 290 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 2 │ 0 │ 0 │ 90 │10 │360│
│ 2 │ 0 │ 1 │ 140 │ 30 │370 │
│ 2 │ 0 │ 2 │ 200 │ │ │
│ 2 │ 0 │ 3 │ 260 │ │ │
├─────┼──────┼──────┼────┼──┼──┤
│ 2 │ 1 │ 0 │ 150 │ 30 │440│
│ 2 │ 1 │ 1 │ 200 │ 70 │890│
│ 2 │ 1 │ 2 │ 270 │ │ │
│ 2 │ 1 │ 3 │ 34o │ │ │
└─────┴──────┴──────┴────┴──┴──┘ 注:①本表采用3个稀释度〔1mL(g)/0.1mL(g)和0.01mL(g)〕,每稀释度3管。 ②表内所列检样量如改用10mL(g)、1mL(g)、和0.1mL(g)时,表内数字应相应降低10倍; 如改用0.1mL(g)、0.01mL(g)和0.001mL(g)时,则表内数字应相应增加10倍。其
余可类推。 |